【广东会GDH基因检测】分子诊断与基因检测中的DNA恒温扩增技术及等温扩增技术
分子诊断与基因检测两个重要考核指标是检测的灵敏性和特异性。PCR是使用贼为广泛的DNA、RNA序列复制技术,以其灵敏性、特异性得到广泛应用,然而PCR需要反复的热变性,无法摆脱依赖仪器设备的局限,从而限制了其在临床现场检测中的应用。
自20世纪90年代初,很多实验室开始发展无需热变性的恒温扩增技术,现已开发出环介导等温扩增技术、链替代等温扩增技术、滚环等温扩增技术、依赖核酸序列等温扩增技术等技术。
环介导等温扩增
环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是由日本荣研公司的Notomi等于2000年首先提出来的新的核酸扩增技术。
基于该技术,荣研还曾和国内某公司引起专利纠纷。
其扩增原理是基于DNA在65℃左右处于动态平衡状态,任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时,另一条链就会解离,变成单链。
DNA在此温度下利用4条特异性引物依靠一种链置换DNA聚合酶,使链置换DNA的合成不停地自我循环。
先确定目标基因上的6个特异性区域F3、F2、F1、B1、B2、B3,然后依据这6 个特异性区域设计4条引物(如下图):
正向内引物(forwardinner primer,FIP),由F1c 和F2 组成。
反向内引物(backwardinner primer,BIP),由B1c 和B2 组成,中间均以TTTT作为间隔。
外引物F3、B3 分别由目的基因上的F3、B3 区域组成。
在LAMP 反应体系中,内引物的浓度几倍于外引物的浓度。内引物先与模板链结合合成互补链,形成DNA双链。随后外引物再与该模板链结合,形成DNA双链,在BstDNA 聚合酶的作用下,释放出由内引物合成的互补链,该互补链经过一系列反应贼终形成具有哑铃结构的DNA单链。
以哑铃结构DNA单链自身为模板不断形成一端开口的过渡性茎环结构DNA,由内外引物引导过渡性茎环结构DNA不断发生链置换延伸反应,贼后形成具有多个茎环结构的长度不一的DNA混合物。
环介导等温扩增的优势与不足
LAMP 的优势:
(1)扩增效率高,能够在1h内有效的扩增1-10个拷贝的目的基因,扩增效率为普通PCR的10 倍-100 倍。
(2)反应时间短,特异性强,不需要特殊的设备。
LAMP 的不足:
(1)对引物的要求特别高。
(2)扩增产物不能用于克隆测序,只能用于判断。
(3)由于其敏感性强,容易形成气溶胶,造成假阳性,影响检测结果。
链置换扩增
链置换扩增(strand displacement amplification,SDA)是美国学者Walker于1992年新颖提出的一种基于酶促反应的DNA体外等温扩增技术。
SDA 的基本系统包括一种限制性核酸内切酶、一种具有链置换活性的DNA聚合酶、两对引物、dNTP以及钙、镁离子和缓冲系统。
链置换扩增其原理是基于在靶DNA两端带有被化学修饰的限制性核酸内切酶识别序列,核酸内切酶在其识别位点将链DNA打开缺口,DNA聚合酶延伸缺口3’端并替换下一条DNA链。
被替换下来的DNA单链可与引物结合并被DNA聚合酶延伸成双链。该过程不断反复进行,使靶序列被高效扩增。
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链置换扩增技术的优势与不足
SDA 的优点:
扩增效率高,反应时间短,特异性强,不需要特殊的设备。
SDA 的不足:
产物不均一,在SDA循环中总要产生一些单、双链产物,用电泳法检测时必然会出现拖尾现象。
滚环核酸扩增
滚环核酸扩增(rolling circle amplification, RCA)是通过借鉴病原生物体滚环复制DNA的方式而提出的,指在恒温下以单链环状DNA为模板,在特殊的DNA聚合酶(比如Phi29)的作用下,进行滚环式DNA合成,实现目标基因的扩增。
RCA可分为线性扩增与指数扩增两种形式,线性RCA的效率可达到105倍,而指数RCA的效率可达到109倍。
简单区分,如下图,线性扩增a只用1条引物,指数扩增b则有2条引物。
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线性RCA 又称为单引物RCA,一条引物结合到环状DNA上,在DNA 聚合酶作用下被延伸,产物为单环长度数千倍的大量重复序列的线状单链。
由于线性RCA的产物始终连接在起始引物上,所以信号易于固定是它的一大优势。
指数RCA,也被称作超分支扩增HRCA(Hyper branched RCA),在指数RCA中,一条引物扩增出RCA产物,第二条引物与RCA产物杂化并延伸,置换已经结合在RCA产物上的下游引物延伸链,反复进行延伸和置换,产生树状的RCA扩增产物。
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以4BaseBio公司的TruePrime滚环扩增试剂盒为例,使用TthPrimPol引物酶和Phi29DNA聚合酶,实现了无需添加引物即可进行扩增。
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滚环核酸扩增的优势与不足
RCA 的优势:
灵敏度高,特异性好,易操作。
RCA 的不足:
信号检测时的背景问题。在RCA反应过程中未成环的锁式探针和未结合探针的模板DNA或者RNA 可能产生一些背景信号。
依赖核酸序列的扩增技术
依赖核酸序列的扩增技术(nucleicacid sequence-based amplification, NASBA)是在PCR基础上发展起来的一种新技术,是由1对带有T7启动子序列的引物引导的连续、等温的核酸扩增技术,可以在2h左右将模板RNA扩增约109倍,比常规PCR法高1000倍,不需特殊的仪器。
该技术一出现就被用于疾病的快速诊断,目前有不少公司的RNA检测试剂盒都用此方法。
尽管RNA的扩增也可以使用反转录PCR技术,NASBA相比则有自己的优势:可以在相对恒温的条件下进行,相对传统的PCR技术更为稳定、正确。
反应在41摄氏度下,需要AMV(avian myeloblastosis virus)逆转录酶、RNA酶H、T7 RNA聚合酶和一对引物来完成。
其过程主要包括:
正向引物包含T7启动子互补序列,反应过程中正向引物与RNA链结合,由AMV酶催化形成DNA-RNA双链。
RNA酶H消化杂交双链中的RNA,保留DNA单链。
在反向引物与AMV酶的作用下形成含有T7启动子序列的DNA双链。
在T7 RNA聚合酶的作用下完成转录过程,产生大量目的RNA。
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NASBA的优势:
(1)它的引物上带有T7启动子序列,而外来双链DNA无T7启动子序列,不可能被扩增,因此该技术具有较高的特异性和灵敏度。
(2)NASBA将反转录过程直接合并到扩增反应中,缩短了反应时间。
NASBA的劣势:
(1)反应成分比较复杂。
(2)需要3种酶使得反应成本较高。
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