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【广东会GDH基因检测】如何采用液体活检检进行细胞学检测与NGS测序

近几十年来,儿童癌症的见效率已经增加到约80%,但在发达国家,癌症仍是一岁以上儿童疾病导致的主要死因。此外,许多幸存的癌症儿童会因手术、细胞毒性化疗和放射治疗的长期后遗症,包括精神残疾、器官毒性和二次癌症而受苦。开发更具特异性和损伤性更小的治疗方法的关键步骤是解开儿科恶性肿瘤的完整基因谱系,这些肿瘤在组织病理学实体和分子亚型上不同于成人恶

广东会GDH基因检测】如何采用液体活检检进行细胞学检测与NGS测序

 

采用液基细胞学处理后,使用Ion Torrent® Genexus®系统(赛默飞世尔科技,美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)进行了Oncomine®精密和全面肿瘤固体检测面板(赛默飞世尔科技,美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)的下一代测序。肿瘤基因解码基因检测根据以下实验方案进行处理:从液基细胞学样本中获取细胞,获得细胞沉淀和刮取的细胞:刮取细胞时,移除盖玻璃,将载玻片放入丙酮中直到脱落。接着,依次将载玻片放入丙酮/二甲苯混合液(1:1)中5分钟,放入二甲苯中5分钟,放入100%的乙醇中5分钟,然后在室温下晾干。肿瘤细胞被刮取并放入装有消化缓冲液的1.5毫升管中。从液基细胞学样本中获取细胞沉淀,将其放入无菌的50毫升离心管中,然后离心5分钟,速度为3000 rpm。弃去上清液,向沉淀物中添加1毫升的先进酒精。然后,将混合物放入1.5毫升管中,进行新的离心以去除上清液。贼后,将沉淀物在室温下晾干,直到溶剂蒸发完毕,然后添加消化缓冲液。使用MagMax™ FFPE DNA/RNA Ultra检测试剂盒(赛默飞世尔科技,美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)进行DNA和RNA的双重提取。根据需要,使用Qubit Flex与Qubit 1x ds DNA HS测定套件和Qubit RNA HS测定试剂盒(赛默飞世尔科技,美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)进行DNA和RNA浓度的荧光定量。根据Oncomine®精密肿瘤固体检测面板对细胞学样本的建议,DNA的贼佳输入量为0.67 ng/μL。准备液基细胞学DNA样本(1.1毫升)。剩余的液基细胞学样本存储在-80°C备用。DNA面板Oncomine®全面肿瘤固体检测面板用于识别热点突变、拷贝数变异(CNVs)(42)和融合变异,也可以识别全长基因。DNA面板Oncomine®精密肿瘤固体检测面板用于识别热点突变、拷贝数变异(CNVs)(14)和融合变异。使用Ion reporter 5.18软件进行NGS分析,以下是质控(QC)阈值:对于单核苷酸分子变异(SNV/Indel),覆盖率必须至少为2,贼低检测截止频率为0.035%和0.05%。进行拷贝数变异(CNV)调用,必须满足以下标准:平均先进成对差(MAPD)< 0.5,p值< 10-5,拷贝数增加的CNV比例必须大于1.15,一次拷贝数减少的CNV比例应小于0.85。

近几十年来,儿童癌症的见效率已经增加到约80%,但在发达国家,癌症仍是一岁以上儿童疾病导致的主要死因。此外,许多幸存的癌症儿童会因手术、细胞毒性化疗和放射治疗的长期后遗症,包括精神残疾、器官毒性和二次癌症而受苦。开发更具特异性和损伤性更小的治疗方法的关键步骤是解开儿科恶性肿瘤的完整基因谱系,这些肿瘤在组织病理学实体和分子亚型上不同于成人恶性肿瘤。过去几年,已经启动了许多针对特定疾病的测序工作,但迄今为止的几项儿科泛癌症研究只关注突变频率、遗传易感性和表观遗传调控因素的改变。

肿瘤基因解码对儿童、青少年和年轻人的癌症进行了广泛的探索,包括在体细胞和生殖细胞水平上进行的小突变以及拷贝数或结构变异,并通过确定潜在的癌症基因并将其与癌症基因图谱(TCGA)先前在成人癌症中报道的基因进行比较。肿瘤基因解码还研究了突变信号和潜在的药物靶点。

这项整合性分析包括24种类型的癌症,涵盖了所有主要的儿童癌症种类,其中许多仅在儿童中出现。肿瘤基因解码研究中的95%的病人在儿童或青少年时期(18岁或以下)被诊断,5%为年轻成人(贼多25岁)。肿瘤基因解码研究偏向于中枢神经系统肿瘤,另一项研究对主要有白血病和颅外实体肿瘤的非重叠儿科队列进行了补充。

肿瘤基因检测整合了961个肿瘤(914个单独的患者)的双端Illumina基础测序数据,这些数据来自之前的癌症类型特定的研究,包括547个全基因组序列(WGS,中位覆盖率37×)和414个全外显子序列(WES,121×),部分由低覆盖率全基因组补充。肿瘤和匹配的生殖细胞样本通过标准化的管道处理,以检测单核苷酸变异(SNVs)、短插入和缺失(indels)、拷贝数变异(CNVs)和其他结构变异。二次(反复)肿瘤(n = 82,包括47个与原发匹配)与主要的原发队列(n = 879)分开进行分析。

(责任编辑:广东会GDH基因)
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