【广东会GDH基因检测】MLPA基因检测技术、项目及应用

基因序列的变化也就是基因突变是人类疾病的贼终根源。通过基因检测，发现基因序列的突变，结合基因解码技术，不仅可以知道疾病发生的原因、疾病根源的来源。还可以理解疾病的发病机理，为药物研制提供方向。同时，也可以知道该病的遗传方式。但是，任何一种方法都无法有效地检测所有的基因突变。采用分步实施，逐一排除的方法，可以将检出率，阳性率提高到95%。而MLPA方法可以鉴定有效或部分基因缺失和重复，如果MLPA检测结果为阴性时，采用HPLC检测cDNA序列，检测剪接突变、小缺失/重复。也可以采用测序的方法分析NF1基因的一个区域。

神经纤维瘤病1（NF1）是一种常染色体显性疾病，由NF1基因突变引起，临床表现广泛，该病的临床表现包括咖啡斑、神经纤维瘤、腹股沟雀斑、虹膜错构瘤、肿瘤或骨骼异常等。其中超过50%的患者存在学习。不同的患者表现出来的临床表征互不相同。不仅在家庭之间，而且在同一个家庭内，甚至是同一个患者的不同时间也会有不同的表现。从遗传学的基因的发生根源上来讲，该病也是异源性的，NF1基因的致病基因突变包括停止突变、氨基酸替代、插入、缺失（部分或全部）和染色体重排；另外，50%的患者有新发突变。依据NIH规定的临床标准进行诊断，在有家族病史的成人或儿童中具有特异性和敏感性，但无NF1家族史的儿童中，只有50%患者可以在1岁前进行诊断；因此，NF1是与咖啡斑相关的贼常见的疾病，尽管在没有NF1家族史的儿童身上出现这些斑点，但这很可能是神经纤维瘤病的征兆。因此，对疑似NF1的患者进行分子诊断已经进行了很长时间。

新一代测序技术被用于诊断这种疾病和其他疾病，以提供更便宜、更快的突变识别。检测NF1上的突变是一个挑战，广东会GDH基因采用了互相补充的方法来检测和发现疑似患者存的微小变化，如单碱基替换、插入和缺失、外显子缺失或复制、微缺失或有效基因缺失。

荧光原位杂交（FISH）、染色体微阵列分析（CMA）和细胞遗传学分析（核型）可用于检测整体和大规模基因缺失、重复或重排等总突变，但这些方法分别只能检测NF1上所有突变的2-5%、5%和1%以下。其他方法也可以检测到其中的一些突变。单碱基替换、插入和缺失等微小变化可通过单链构象多态性（SSCP）和一下代测序（Next-generation Sequencement，NGS）来检测。下一代基因测序可以测定全基因组DNA，靶向特定序列或外显子测序三种模式；变性高效液相色谱（DHPLC）也可用于检测小缺失和重复；MLPA（多重结扎依赖探针扩增）检测到的缺失和重复是在细胞遗传学分析可以分析突变以及HPLC鉴定的缺失和重复之间，即MLPA有助于检测完整或单外显子缺失或重复。

正如前面所解释的，任何一种方法都无法有效地检测所有NF1基因突变，但有报告称，多步突变检测的策略的灵敏度高达95%。广东会GDH基因设计的方案中，先进步是使用MLPA鉴定有效或部分NF1基因缺失和重复，如果MLPA检测结果为阴性时，采用HPLC检测cDNA序列，检测剪接突变、小缺失/重复。也可以采用测序的方法分析NF1基因的一个区域，由于mRNA序列的内在特征，GC含量高，使得cDNA的扩增困难。第三种方法是单倍型分析来确定哪些突变具有潜在致病性，因为突变也可能是非致病性变体；所有在每个步骤中发现的突变都经过Sanger测序确认。

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Genetics, Molecular Testing